Die Anlage der Anaërobenkulturen geschieht in anderer Weise, und zwar nach der Methode Liborius und Buchner.
Im ersten Falle wird wieder der fein geschnittene Tabak aus der mit Wasserstoff gefüllten Glocke in flüssige Gelatine gebracht und verteilt, und hiervon werden wieder die nämlichen Verdünnungen gemacht. In kaltem Wasser lässt man die Gelatine fest werden und nachher wird die ganze Röhre bis zum Wattepfropfen mit steriler Gelatine angefüllt (fig. 4, B).
Im zweiten Falle wird der Tabak aus der nämlichen Glocke in derselben Weise in die Gelatine-Röhre hineingebracht und werden gleichfalls Verdünnungen angelegt. Nachdem die Gelatine fest geworden ist, wird der Wattepfropfen fast bis zum Gelatine-niveau geschoben und nachdem der obere Teil der Röhre mit einem Diamanten abgeschnitten worden ist, wird diese kurze Röhre in eine weite Reagirröhre auf ein sich dort befindendes kleines Stück Metallgaze gebracht (fig. 4, C). In diese grosse Röhre ist unter das Drahtnetz, welches der Kulturröhre zum Ruhepunkt dient, 2 Gramm Pyrogallol gebracht. Wenn dies alles fertig ist, lässt man mit einer Pipette 10 cm3 von einer 1 % KOH-lösung in die weite Röhre hinein fliessen und schliesst dann sofort die Röhre mit einem gut schliessenden Kautschukstöpsel, der obendrein noch mit Paraffin umgeben wird.
Nach beiden Methoden gelangen die Anaëroben zum Wachstum und bilden, obgleich langsam, gut sichtbare Koloniën. Damit man hiervon Impfungen machen kann, wird die Gelatineröhre an denjenigen Stellen mit einem Diamanten durchschnitten, an denen man die Kolonien mit einer Nadel erreichen kann. Auch diese Impfungen, Strich- oder Stichkulturen, geschehen derartig, dass entweder durch das Aufgiessen von Gelatine oder in der genannten Weise mit alkalischer Pyrogallollösung die Anaëroben sich in dem sauerstofffreien Raum entwickeln können. Auf diese Weise habe ich eine Anzahl Versuche gemacht, und als sich ergab, dass die Anaëroben fakultative Anaëroben waren, wurden die Versuche mit der alkalischen Gelatine in Petri'schen Schälchen fortgesetzt. In der Zwischenzeit, im Winter von 96-97, wurde mir, wie beschrieben ist, durch chemische Analyse bekannt, welche Stoffe bei der Fermentation angegriffen wurden. Damals ist der Nährboden, wie folgt, von mir geändert worden:
| alkalische Gelatine (Koch) | 100 |
| Kalium-nitrat | 0.2 |
| Asparagin | 0.1 |
| Glycerin | 1.5 |
| Glucose | 0.5 |
| Nicotin | Spuren. |
Auf diesem Boden entwickeln die Kolonien sich schneller und in grosser Menge. Ein Beweis, wie nützlich es ist, eine Untersuchung, welche ursprünglich nur die Gährung betraf, auf ein völliges Studium des Tabaks auszudehnen.
Bei der Untersuchung der Platten zeigen sich noch eine Menge Schwierigkeiten, welche zu Irrtum Veranlassung geben könnten. Sehr verführerisch scheinen die Verdünnungsplatten, auf denen sich 10 oder 20 Kolonien zeigen, die makroskopisch gleich aussehen und doch nicht bei der Gährung funktionieren: ich betrachte dieselben entweder als zufällige örtliche Verunreinigungen in dem gährenden Tabak, oder als Kolonien, welche durch Teilung einer Bakterienkette während der mechanischen Behandlung beim Anlegen der Kulturen entstehen. Im ersteren Falle finden sich doch im gährenden Tabak die Lebensbedingungen für eine bestimmte Bakterienart; es ist dort, dass sie örtlich zur Entwicklung und Vermehrung kommen.
Dergleichen Erscheinungen beim Anlegen der Kulturen erschweren die Untersuchungen. Auch später fand ich bei den Untersuchungen der lebenden Blätter, dass ihre Oberfläche durch das Wachstum bestimmter Bakterienarten eingenommen wird (Rhizobium Frank u. a.). Auch hier scheint also auf der Blattoberfläche der Kampf ums Dasein zu bestehen. Nicht selten gelang es mir, von den Blättern die nämlichen Arten zu isolieren. Der Gebrauch starker Verdünnungen ist bei Untersuchungen wie diese Hauptsache. Ein Quantum gährenden Tabaks, welches noch nicht die Oberfläche von einem Gulden einnahm, brachte in einzelnen Fällen tausende Kolonien zur Entwicklung. In einem zuerst angelegten Petri-Schälchen berechnete ich einmal 40.000 Kolonien, ein Beweis, dass Verdünnung das angezeigte Mittel ist, Ordnung in das Chaos zu bringen.
Von dem Tabak, welcher in den Schälchen und in der Glocke zum Gähren gebracht wurde, wurden einmal die Woche, neun Wochen lang, die Kulturen angelegt. Dadurch, dass eine grosse Menge Platten auf diese Weise untersucht wurden, war es nicht schwer, diejenigen Kolonien zu isolieren, welche schon in grosser Masse anwesend waren. Besonders in den ersten Wochen zeigten sie sich in wachsender Anzahl und verursachten deshalb nicht selten, dass die Platten ganz sich verflüssigten, ungeachtet der starken Verdünnungen, auf die man soviel Sorgfalt verwendet hatte. In derselben eben beschriebenen Weise wurden in Wageningen die Kulturen angelegt.
Fast nie fehlte der B. mycoides und der B. subtilis; beide sind streng aërobe Bakterien. Ersterer bildet NH3 aus Eiweiss, doch lebt nur in O-haltigen Räumen, der zweite könnte gleichfalls bei der Gährung die Rolle spielen, dass er daran mitarbeitet dem Haufen die nötige Temperatur zu geben. Der B. subtilis, der nach Cohn die Brühung des Heus und des Stalldüngers verursacht, könnte gleichfalls in dem bereit stehenden Haufen den noch anwesenden freien O verbrauchen.