Die mikroskopische Untersuchung der kranken Blattteile bringt nicht viel an's Licht. Man sollte eigentlich das Gegenteil vermuten, da doch gerade das Krankheitsbild hier so scharf umschrieben ist. Im allerjüngsten Zustand der Fleckchen bei sehr jungen Blättern, wo noch keine Trennung in Pallisaden- und Schwammparenchym stattgefunden hat, trifft man zwischen den Zellen dunkelblaugrün aussehende Streifen sowie Bläschen an, die man am besten mit Luftstreifchen vergleichen kann, welche sich zwischen den Zellenwänden befinden (D). Es ist mir nicht gelungen, die Flecken dadurch zum Verschwinden zu bringen, dass ich ein Blatt in einen luftleeren Raum brachte und darin behielt. Auch in einem älteren Stadium, wo bereits die Trennung zwischen Pallisadengewebe und Schwammparenchym eingetreten ist, werden Streifen und Bläschen noch angetroffen (E). Macht man einen Längsschnitt, dann wird wieder dasselbe wahrgenommen (F H). Stets zeigen sich bei den dunkelgrünen Flecken obige Abweichungen zwischen den Zellen, die ich durch schwarze hier und da untergebrochene Linien angegeben habe (D E F H). An der Oberhaut (I) werden keine Veränderungen beobachtet. Betrachtet man die Flecken C bei stärkerer Vergrösserung, dann sieht man die Oberhaut zusammengeschrumpft, vertrocknet und verfärbt. Das Chlorophyll ist desorganisiert und die Zellwände sind verschwunden. Es ist gerade so, als ob Insekten das Blattparenchym weggefressen hätten (G). Dies sind die einzigen Veränderungen, die mit dem Mikroskop beobachtet werden konnten.

Eine grosse Anzahl Pflanzen ist von mir auf Mikroorganismen untersucht worden, jedoch nur in einzelnen Fällen habe ich Bakterien in Pallisadenzellen gefunden, welche aber nach wiederholter Übertragung auf Nährböden, wobei wie beschrieben das vielleicht vorhandene, unsichtbare Virus verdünnt wurde, keine Pflanzen zu infizieren vermochten. Wiederholte Versuche wurden gemacht, um vermittelst feiner Pincetten von einem kranken Blattteilchen die Epidermis an beiden Seiten zu entfernen, was einige Male gelang. Vom Inneren des Blattes wurden dann Plattenkulturen angelegt, die abgesehen von einzelnen bekannten, sehr viel vorkommenden Pilzcolonien scheinbar steril blieben. Als Nährböden hierfür wurden gebraucht die alkalische und saure Nährgelatine von Koch, Tabakssaft-Gelatine, Malz-Gelatine und der von Beyerinck angegebene Leguminosen-Nährboden. Ebenso entwickelten sich auf oder in einem sauren oder alkalisch reagierenden Nährboden, der wie folgt zusammengestellt war, keine Kolonien: Tabakssaft 5, Kaliumphosphat 0, 050, Asparagin 0,5, Glukose 2,0, Gelatine 10,0 oder Agar 1,5, Wasser 100,0.

Ein einziges Mal entwickelte sich Gas in schwach alkalischer Bouillon, welche zu anaërober Kultur benutzt wurde (verursacht durch einen Organismus, welcher schwierig von Coccen zu unterscheiden ist).

Viele Male sind auch grössere kranke Blattteile zur Untersuchung genommen worden. Zuerst wurden die beiden Blattoberflächen gut abgewaschen, dann mit sterilen, nassen Wattepfropfen abgerieben und darauf mit sterilem Wasser abgespritzt. Es gelang mir unter einer ganzen Reihe von Platten mehrere Male, Mikroorganismen zu isolieren, die, von der Plattenoberfläche genommen, junge Tabakspflanzen krank machten. Die Krankheit trat nicht stets ein, wenn ich mit viele Malen übergeimpften Kulturen arbeitete. Ich erreichte eine Erkrankung mit drei Mikroorganismen, mit einem Rhizobium Leguminosarum, einer Beggiatoa- und einer Streptothrix-Art. Wie gesagt, trat eine Erkrankung öfters nicht ein, wenn ich Überimpfungen gebrauchte. Das fiel mir besonders auf, und bestärkte mich in meiner schon oben erwähnten Ansicht, dass die von den ursprünglichen Platten abgenommen Kulturen ein unbekanntes, unsichtbares Gift, wenn auch in höchst starker Verdünnung, enthielten; denn eine minimale Menge Saftes von krankem Gewebe ist immer im Stande, die Fleckenkrankheit zu verursachen.

Im Oktober 1897 wurde in einen kühlen Treibkasten Tabakssamen gesät, um Versuchspflanzen zu bekommen. In der Zwischenzeit wurde Erde, in der kranke Pflanzen gestanden hatten, und die an deren Wurzeln hängende Erde auf Mikroorganismen untersucht. Nach Lage der Sache ist dies eine sehr schwierige Untersuchung, wenn man bedenkt, dass die Anzahl Mikroorganismen per Gramm darin einige Hunderttausenden bis Millionen beträgt. Aus einer grossen Anzahl Platten wurden damals 8 Mikroorganismen isoliert, die im Februar 1898 auf junge Pflanzen geimpft, die Fleckenkrankheit nicht hervorbrachten. Sie waren also nicht das ätiologische Moment derselben. Auffallend war es, dass an den jungen Wurzeln der Tabakpflanzen häufig Streptothrix chromogena Gasperini angetroffen wurde.

Dieser Mikroorganismus, welcher zur Familie der Streptothricheen oder besser Actinomyceten gehört, hat in seiner Form viel Ähnlichkeit mit den Fadenpilzen, auch erinnert er an die Bakterien. Ebenso wie die Pilze bildet er aus runden Keimzellen (Sporen) cylindrische Fäden, welche sich dichotomisch verzweigen, und sich dem unbewaffneten Auge als ein Mycelium darstellen. Einige fruchttragende Hyphen erheben sich über dem Substrat in die Luft und fallen dann, als Oldien in Ketten von runden Keimzellen oder Sporen aus einander. Bei starker Vergrösserung zeigen die Streptothricheen viel Ähnlichkeit mit den Bakterien. Es sind sehr dünne Faden, welche ursprünglich keine Scheidewände besassen, und welche sich durch Sprossungen verzweigen. In älteren Kulturen zerfallen die Fäden in kurze Stäbchen und kokkenartige Glieder. Nicht selten findet man auch die Spirillenform, weil die Streptothricheen stark gekrümmt und gewunden sind. Die Untersuchungen, welche in der letzten Zeit über diese Pilzgruppe angestellt wurden, haben die Frage aufwerfen lassen, ob sie nicht im genetischen Verhältnis zu der Gruppe der Diphtherie und der Tuberculose stehen.

Dies ist noch nicht ganz sicher festgestellt, jedoch könnten dann die beiden letzteren Gruppen von den Actinomyceten hergeleitet werden. Es sind sehr verbreitete Saprophyten, die pathogenen unter denselben (Aktinomyces bovis etc., S. sen A. violacea u. a.) scheinen nicht selten parasitisch werden zu können. Genannte S. sen A. chromogena Gasperini ist bekannt als einer, der aus Nitraten leicht Nitrite bildet. Wie sich später zeigen wird, ist er nicht als pathogen für Nicotiana zu betrachten, wiewohl ich nach Impfung der Pflanze mit Erde eine Veränderung im Blatte traf.

Häufig habe ich, wie ich schon in »de Natuur« pg. 330, 1899 beschrieben habe, den St. sen A. chromogena in den Risse der verwitternden Granite, Basalte und Hornblendeschiefer der erratischen Blöcke unseres Gooiländischen Diluviums, und in Zandbergen's Waldboden, wenn ich nach Frank's Mykorhizen vergebens suchte, aufgefunden.

Wenn der Löffler'schen Bouillon ein wenig Nitrat zugesetzt wird, so ist innerhalb 24 Stunden nach Impfung mit diesem Pilze durch das bekannte Reagens schon Nitrit nachzuweisen. In Leitungswasser geschieht dies nicht.