En Roma se encontraba cuando el saqueo de la ciudad en 1527 por las tropas de Borbón, y de allí se trasladó á Pisa, volviendo después á la ciudad de los césares, en donde trabajó con verdadero entusiasmo y afán, estudiando las maravillas artísticas.
En Italia—ha escrito un autor—Luís de Vargas «se encontró con un arte exhumado, con un mundo desenterrado. Aquellos mármoles desnudos, aquellas formas tan correctas, eran un ideal que resucitaba, que se hacía necesario, porque la Edad Media había atronado la forma, había roto la proporción y este mal tenía que desaparecer.»
Trabajó de continuo y lleno del mayor entusiasmo, vivió Luís de Vargas en Italia unos 28 años, según apuntan sus biógrafos, regresando al cabo á Sevilla, donde contrajo matrimonio.
En su ciudad natal comenzó á trabajar Luís de Vargas, llamando bien pronto la atención sus obras ejecutadas al óleo y al fresco, que desde entonces tuvieron grandes apasionados é imitadores.
A Luís de Vargas acudieron no pocos jóvenes deseosos de recibir sus lecciones, teniendo discípulos tan aventajados como Diego de Concha, Lucas Valdivieso, Francisco Venegas y Luís Fernández.
Dice Pacheco en su libro de Verdaderos retratos, que al ver Luís de Vargas las obras que por entonces ejecutaba en Sevilla Pedro de Campaña, deseando perfeccionarse más en el arte, tornó á Italia, donde permaneció dos años, al cabo de los cuales volvió á su patria, dando entonces comienzo la época más fecunda de su vida en producciones artísticas.
Entonces ejecutó en el templo de San Pablo el fresco de la Virgen del Rosario (hace mucho tiempo desaparecido), el San Miguel dominando al demonio y la Virgen, que se encuentra hoy en el Museo de Louvre, y algunos retratos notables, como el de la duquesa de Alcalá y el del padre Contrera, que existe en la sacristía de los Cálices.
En 1552 fundó el mercader Francisco Baena la capilla del Nacimiento en la Catedral, pintando para el retablo Luís de Vargas ocho tablas, representando en la principal la Adoración de los pastores, y en las otras los Evangelistas, la Encarnación, la Circuncisión y la Epifanía.
Al número de veintiocho llegaron las obras que Luís de Vargas dejó á la Basílica sevillana, sobresaliendo de entre todas el cuadro llamado de la Gamba en la capilla de la Concepción.
Esta tabla, verdadera joya de arte, que representa una alegoría de la Concepción, ha sido unánimemente elogiada, y con razón dice de ella un crítico: «Lo grandioso del dibujo, la valentía de las actitudes y la riqueza del colorido superan á todo encarecimiento.» En el mismo retablo se ven, pintados también por Luís de Vargas, los apóstoles San Pedro y San Pablo, los doctores de la Iglesia y el retrato del Chantre Juan de Medina, fundador de la capilla.