Y cuando ya, en descenso la ola del entusiasmo, pensábase que aquellas elegantes redes intracelulares eran quizá algo privativo de los vermes, apareció en el palenque otro investigador de grandes arrestos. Fué el fisiólogo A. Bethe[207], á la sazón profesor de Strasburgo, quien puso la cuestión nuevamente á la orden del día, sorprendiéndonos con importante Memoria, donde, auxiliado por un método especial (combinación de un mordiente, el molibdato amónico, con un colorante, el azul de toluidina), demostró las fibrillas ó neurofibrillas de los vertebrados, señaladamente las contenidas en las voluminosas células de la médula, ganglios, cerebelo, etc. Fascinados por la importancia y novedad de las revelaciones de Bethe, todos quisimos colaborar en la empresa, esperanzados de nuevas y estupendas conquistas.
Mas el sino adverso continuaba influyendo. El enrevesado proceder de A. Bethe no estaba al alcance de todo el mundo. Como el de Apáthy, sólo floreció en el Laboratorio de su autor ó en las manos de poquísimos iniciados. En cuanto á mí, logré á fuerza de paciencia algunas mediocres é insuficientes coloraciones. Y atribuyendo el fiasco á la impericia del principiante, demandé cortésmente al ingenioso creador del método alguna preparación típica para confrontarla con las mías.
Semanas después recibía, cuidadosamente embaladas, cual objeto precioso, dos preparaciones: una, del cerebelo; otra, de la médula espinal del conejo.
—Estos preparados son excepcionalmente buenos —escribíame el profesor de Strasburgo—. Han sido ejecutados por el más aventajado de mis discípulos. Ponga usted cuidado en su manejo y devuélvamelos lo antes posible, porque no dispongo de otros por ahora.
¡Oh decepción!... ¡Las joyas técnicas, aquellos preparados inestimables desembalados con emoción y examinados con el corazón palpitante, no sobrepujaban á los míos!... Ciertamente, dentro del protoplasma nervioso advertíanse las neurofibrillas impregnadas de violado; pero tan pálidas en el seno granuloso de la ganga del citoplasma, que resultaba imposible reconocer netamente su disposición real y sus conexiones con las demás texturas extracelulares. ¡Y sobre tales imágenes había construído Bethe formidable edificio teórico! En vano me afanaba en buscar el trayecto exterior de tan sutiles filamentos. Sin embargo de lo cual, el sabio de Strasburgo nos hablaba, con sorprendente aplomo, del enlace substancial de aquéllos con la red pericelular de Golgi, red á su vez caprichosamente interpretada (con olvido ó menosprecio de todas las terminantes revelaciones de los métodos de Golgi y Ehrlich) como la porción terminal de las fibras nerviosas. Á la verdad, poco exigente se mostraba el fisiólogo alemán en cuanto al objetivismo de los datos sobre que asentar magnas conclusiones.
Ardía yo en deseos de contemplar las susodichas neurofibrillas en preparaciones irreprochables. Desilusionado de las técnicas aleatorias é insuficientes de Apáthy y Bethe; imposibilitado, además, de ensayar la de Donaggio, conservada en secreto, y persuadido, en fin, de que para la coloración vigorosa de tan sutiles hebras era inexcusable recurrir á las reducciones metálicas, entreguéme porfiadamente, desde 1901, á numerosos ensayos de impregnación; aprovechando unas veces la reacción del óxido de plata amoniacal, descubierta por Fajersztajn (1901); otras, la del cloruro de oro en presencia del tanino y del ácido pirogálico; algunas, en fin, las sales haloides de plata y los reductores fotográficos introducidos en la técnica por Simarro (1900). Fruto inicial, aunque poco importante, de aquella obstinada labor, fueron ciertas fórmulas de coloración de los cilindros-ejes y de la mielina[208]. Pero el esqueleto neurofibrillar y las terminaciones nerviosas centrales, objetivo principal de mis afanes, resistíanse obstinadamente.
Á tan empeñadas probaturas incitábame, no tanto la esperanza de topar con un proceder fácil de demostración de la urdimbre intraneuronal, cuanto el ansia de descubrir fórmula de impregnación susceptible de provocar coloraciones intensas, al par que perfectamente transparentes, de las células y fibras nerviosas. Anhelaba contrastar una vez más las bellas revelaciones del cromato de plata con las de otro recurso al que no pudiera reprocharse el defecto de traducir el soma celular y sus expansiones en siluetas opacas, sin vislumbre de estructura. En fin, me ilusionaba la esperanza de procurarme un arma poderosa que esgrimir contra muchos novadores técnicos, inclinados irresistiblemente al vicio anárquico de negar, en nombre de una nueva verdad, las verdades descubiertas por otros.
Después de infructuosas tentativas con las técnicas precedentes, consagré en 1903 particular atención al método del Dr. Simarro[209], primer autor que logró teñir las neurofibrillas mediante las sales de plata.
Consta la técnica del ilustre neurólogo español de seis operaciones esenciales: 1.ª Envenenamiento de los animales, durante varios días, con dosis crecientes de bromuro ó de yoduro de potasio. 2.ª Inmersión por varios días (dos á diez) de trozos de médula espinal en solución al 1 por 100 de nitrato de plata, al objeto de provocar en los tejidos la formación de yoduro ó bromuro argénticos ú otras combinaciones argéntico-orgánicas. Cuando los animales no son envenenados, el nitrato sólo produce, naturalmente, cloruro y albuminatos argénticos. 3.ª Induración rápida de las piezas en alcohol é inclusión subsiguiente en celoidina para efectuar secciones microtómicas, operaciones que se practican en la obscuridad. 4.ª Exposición de los cortes á la luz como si fueran papeles fotográficos. 5.ª Revelación de las secciones en el cuarto obscuro, mediante un reductor fotográfico, por ejemplo: el ácido pirogálico, la hidroquinona, etc., adicionados de sulfito sódico y de un álcali enérgico. En fin, fijado en hiposulfito de sosa.
El haloide argéntico (bromuro, yoduro ó simplemente el cloruro), seleccionado por las células y fibras nerviosas, conviértese por reducción en depósito metálico finísimo, de matiz pardo ó rojo. Según el autor del método, las neurofibrillas aparecerían solamente en las piezas bromuradas ó yoduradas. En las simplemente cloruradas parece no haberlas visto.
Por desgracia, y por lo que toca á la presentación de las neurofibrillas, el ingenioso método del sabio español dista mucho de ser constante. Y, cuando por raro caso, lógranse resultados excelentes, el depósito argéntico escoge de manera casi exclusiva el armazón de las grandes y medianas células de la médula espinal y bulbo raquídeo. Imposible obtener coloraciones neurofibrillares en el cerebro, cerebelo, ganglios y terminaciones nerviosas. Los axones mismos imprégnanse con gran irregularidad. Mis primeras tentativas, pues, siguiendo la técnica puntualizada por el Dr. Simarro, fueron poco afortunadas. Estábamos, al parecer, condenados á no disponer jamás de un recurso analítico constante y general para el teñido del esqueleto neurofibrillar. Recuérdense los azarosísimos resultados de las técnicas de Apáthy y Bethe.
Antes de abandonar dicho método, resolví analizarlo escrupulosamente, variando sus momentos operatorios y determinando, si ello era posible, las causas de su desalentadora inconstancia. Á este propósito, comencé por modificar una de las condiciones, ó sea el envenenamiento de los animales. En vez de yoduros y bromuros, usé diversas sales metálicas, sólo venenosas á dosis casi masivas (ferrocianuro de potasio, ferricianuro, sulfato de cobre, etc.); varié metódicamente el tiempo de permanencia de las piezas en la estufa, así como la proporción del nitrato de plata; prescindí de la acción de la luz y de los reveladores alcalinos, usando los llamados por tratadistas de fotografía reductores físicos, etc.
De este esmerado análisis experimental obtuve ya tres enseñanzas valiosas. 1.º Que la coloración neurofibrillar no tiene nada que ver con el envenenamiento de los animales, puesto que se obtiene lo mismo en los envenenados con sales de cobre y hierro que en los no intoxicados. 2.º Que se precisa el concurso del calor, no bastando la inmersión de las piezas en el nitrato de plata, por veinticuatro ó cuarenta y ocho horas, sino el uso de la estufa á 37° durante cuatro días, ó con temperatura del verano (22° á 27°) por ocho ó nueve. (Esta influencia del calor fué ya sospechada, aunque no precisada, por Simarro, cuando mentaba la madurez de la emulsión de bromuros y yoduros). 3.º Que, en fin, en las preparaciones de Simarro (solarizadas y reveladas como placas fotográficas) existen entremezcladas perjudicándose mutuamente, dos reacciones, de naturaleza diferente: una constante, y poco instructiva, la provocada por la luz sobre cloruros y demás combinaciones argentico-protéicas (teñido en negro granuloso ó pardo de las estrangulaciones de Ranvier, estrías de Fromman, coloración parcial de los gruesos axones, etc.); y otra eventual, afotogénica, muy instructiva, consistente en la impregnación en tono rojo ó café de las neurofibrillas y nucleolos y motivada probablemente por el depósito selectivo de plata coloidal.
Pero si los yoduros y bromuros impresionados por la luz no concurren á la reacción neurofibrillar, ¿cuál es la combinación argéntica eficaz? ¿Será el cloruro de plata? Ello parecía improbable, porque los cloruros, en presencia de los reductores alcalinos, no generan plata coloidal, sino precipitaciones groseras. ¿Cuál es, pues, esta materia enigmática y en qué condiciones se produce?
Todos estos ensayos é inducciones produjeron un solo efecto: simplificar la técnica del sabio español, descartando la enfadosa operación del envenenamiento de los animales y evitando la acción perturbadora de la luz. Mas, á pesar de todo, malográronse mis esperanzas de prestar á la coloración neurofibrillar constancia, vigor y generalidad. Comparables en principio con las de Simarro, mis preparaciones no decían nada nuevo.