Un abus aussi monstrueux ne pouvait être toléré par l'Église, qui avait si énergiquement protesté contre le combat judiciaire.
Le concile de Trente, par un canon (encore en vigueur aujourd'hui) de l'année 1563 (Session 25, De Reformatione, chap. XIX) fulmina l'excommunication non seulement contre les combattants, mais contre les parrains (témoins), et priva de la sépulture chrétienne ceux qui trouvaient la mort dans le combat. (Voir ce canon aux Pièces justificatives, page [453].) Nous résumerons ici les règles que les duellistes reconnaissaient au XVIe siècle (Voir Brantôme, Discours sur les duels).
Il commence par recommander de ne pas se battre sans témoins, d'abord pour ne pas priver le public d'un beau spectacle, et ensuite, pour ne pas s'exposer à être recherché et puni comme meurtrier.
«Les combattants, ajoute-t-il, doivent être soigneusement visités et tastés pour savoir s'ils n'ont drogueries, sorcelleries et maléfices. Il est permis de porter reliques de N. D. de Lorette et autres choses saintes. En quoi pourtant il y a dispute, si l'un s'en trouvait chargé et l'autre non, car dans ces choses, il faut que l'un n'ait pas plus d'avantages que l'autre. Il ne faut pas parler de courtoisie; celui qui entre en champ clos doit se proposer de vaincre ou de mourir, et surtout de ne se rendre point, car le vainqueur dispose du vaincu tellement qu'il en veut, comme de le traîner par le camp, de le pendre, de le brusler, de le tenir prisonnier, bref, d'en disposer comme d'un esclave.» En lisant les mémoires des contemporains, on est édifié sur la quantité de meurtres que l'on regardait comme des duels, on en trouve mille preuves dans les ouvrages de Brantôme, de d'Audiguier, de L'Estoile, de Tallemand des Réaux, etc.
Le pouvoir civil tenta de s'associer à l'Eglise dans la voie de répression.
En 1560, les États généraux réunis à Orléans avaient présenté leurs doléances et leurs demandes pour obtenir la répression des duels. Le roi Charles IX y fit droit par une ordonnance rendue à Marchois en 1566 (en même temps que la célèbre ordonnance de Moulins, mais par un acte séparé) et dont l'honneur revient au chancelier de L'Hôpital. Cette ordonnance défend aux gentilshommes de vider leurs querelles par des combats, leur enjoint de soumettre les démentis au gouverneur de la province, au connétable et aux maréchaux de France, lesquels décideront de la valeur du démenti et pourront le déclarer nul: en ce cas, celui qui l'aura donné sera tenu d'en faire amende honorable à celui qui l'aura reçu.
Il convient de noter ici un point essentiel: Cette sage ordonnance ne se contentait pas de punir les duels, mais elle s'attachait à les prévenir, en assurant une légitime satisfaction à celui qui aurait reçu un démenti ou toute autre injure. Ce n'est pas tout d'édicter des lois, il faut veiller à leur impartiale exécution. C'était précisément ce qui manquait. Quand les coupables, souvent favoris ou fidèles serviteurs du roi, demandaient grâce, il ne savait pas résister. Le mal ne faisait donc que s'accroître en raison de l'impunité accordée à la faveur.
Pour donner satisfaction à l'opinion publique et faire droit aux réclamations formulées par les États généraux, rassemblés à Blois en 1575, une ordonnance royale, rendue dans cette ville en 1579, confirme par son article 194 les précédents édits, et l'article 278 déclare criminels de lèse-majesté les gentilshommes qui se réuniraient pour vider leurs querelles particulières.
Ce fut en 1580 que s'introduisit la règle pour les seconds de prendre fait et cause pour leurs tenants; jusque-là, ils n'avaient été que témoins. Ce déplorable usage est, avec juste raison, blâmé par Montaigne.