Rien de plus triste que l'histoire de Florence à partir de ce temps. Soumise à toutes les exactions pontificales, une malheureuse campagne contre Sienne amenait le connétable de Bourbon devant ses portes, sans qu'elle eût pour cela le courage de secouer le joug des bâtards, et il ne fallut rien moins que l'effroyable sac de Rome (1527) et les horreurs de la domination espagnole avec la captivité de Clément VII pour la décider enfin à secouer son esclavage par un soulèvement unanime.
Mais, les tyrans chassés, il s'agissait encore de gouverner à leur place, et le fonctionnement d'un gouvernement était d'autant plus difficile que le peuple, gorgé de plaisirs matériels et de grossières délices, avait perdu le goût de la liberté, et que les citoyens eux-mêmes n'avaient plus ni la notion de l'indépendance ni le sens de l'autorité. Aussi le gouvernement, péniblement organisé, fonctionna-t-il péniblement au milieu de cruelles incertitudes, et la Seigneurie dut se débattre dans de terribles crises intérieures et extérieures qu'elle était impuissante à résoudre.
La politique cauteleuse et machiavélique suivie à cette époque par Florence devait lui être néfaste. Elle flottait indécise, sans s'arrêter à un parti, entre l'alliance de la France et la protection espagnole, et le seul résultat de ses tergiversations fut de l'isoler complètement et de la livrer sans défense aux ressentiments de Clément VII. Le pape avait tellement à cœur de châtier une ville qui, par une audace sans seconde, s'était soustraite à son autorité, qu'oublieux de ses humiliations, de ses rancunes, il se réconcilia avec l'Espagne, à condition que Charles-Quint l'aidât à reconquérir la Toscane. L'Empereur, trop heureux de faire à si bon compte sa paix avec l'Église, envahit et dévasta le pays et le soumit au plus effroyable régime discrétionnaire.
Tant d'horreurs réveillèrent l'âme florentine et le grand souffle du passé l'anima de nouveau. Charles-Quint ayant investi la ville, elle se retrouva héroïque et, pendant une année entière, lutta, sublime, contre la famine, la mort et les horreurs d'un pareil siège, tenant tête aux armées réunies de Charles-Quint et du pape. Il fallut, pour venir à bout d'elle, que l'infâme trahison de son capitaine général, Malatesta, acheté par Clément VII, la livrât à ses ennemis. La noble attitude des assiégés, en commandant l'estime et l'admiration à leurs adversaires mêmes, leur obtint des conditions moins dures, relativement! car les clauses du traité étaient la mort politique de Florence. Charles-Quint se réservait le droit de la faire gouverner à sa guise, tandis qu'elle était ruinée par une rançon exorbitante et que l'Empereur exigeait le rapatriement des exilés. Bientôt les portes s'ouvraient pour Alexandre de Médicis qu'un rescrit impérial nommait grand-duc de Toscane, le 1er mai 1532. C'était la fin de la République, la fin de ce vaillant petit peuple dont le génie politique et artistique a pénétré le monde.
Le jeune duc Alexandre était de la race redoutable de ces despotes que rien n'arrête. Il abusa sans vergogne de l'autorité et soumit la malheureuse Florence au joug le plus impitoyable. Tandis que ses goûts de débauche l'entraînaient à tous les désordres et à toutes les abominations, l'impunité lui était assurée et sa situation était encore affermie par son mariage avec la fille naturelle de Charles-Quint, Marguerite d'Autriche, la future duchesse de Parme, régente des Pays-Bas. L'appui d'un tel beau-père lui permettait d'étouffer toute tentative de révolte; du reste, si le fantôme de la liberté avait encore pu hanter les esprits, Charles-Quint se serait chargé d'y mettre bon ordre: «considérant les affaires de son gendre comme les siennes». Et, fort de cette assistance, Alexandre n'hésita même pas à tenir tête au pape Paul IV, l'adversaire acharné des Médicis. Le meurtre vint heureusement délivrer Florence de ce monstre. Tous les complots noués contre Alexandre avaient échoué et avaient été noyés dans le sang. Une seule tentative réussit parce qu'elle fut conçue et exécutée par un seul, ce fut celle de Lorenzo de Médicis.
Lorenzo était le chef de la branche cadette descendue de Laurent, le frère de Cosme, et subdivisée elle-même, plus tard, en deux rameaux. De quinze ans plus jeune qu'Alexandre, il avait été élevé à Florence sous la tutelle de sa mère, puis sous celle de Philippe Strozzi. Malgré leurs soins, son caractère étrange ne tarda pas à se développer, singulier mélange de raillerie, d'inquiétude, de désir, de doute, d'impiété, d'humilité et de hauteur, sorte de créature hermaphrodite comme peut en produire la nature aux époques de dissolution. De temps en temps jaillissait de ces éléments hétérogénes un vœu ardent de gloire, de vertu ou d'immortalité, d'autant plus imprévu dans ce corps efféminé qu'en le voyant si mou et si humble, on ne l'appelait plus même Lorenzo, mais, par mépris, Lorenzaccio.
Voilà ce qu'était l'homme qui s'était mis à courtiser le duc Alexandre avec tant d'adresse et une si feinte humilité que non seulement il était devenu son unique ami, mais encore son serviteur complaisant et indispensable pour les besognes les plus honteuses. Le duc avait en lui une confiance absolue, et la preuve la plus certaine qu'il pût lui en donner était de le prendre pour entremetteur dans toutes ses fantaisies amoureuses; aussi Lorenzaccio était encore plus détesté à Florence que le duc lui-même.
Telle était la situation, quand le duc Alexandre s'amouracha d'une femme de vertu inattaquable et de haut rang, cousine de Lorenzaccio, et le chargea de s'entremettre auprès d'elle. Loin d'instruire sa parente, qu'il estimait fort, des desseins du duc, Lorenzaccio vit dans ces circonstances un moyen assuré de se défaire d'Alexandre qu'il haïssait férocement. Après avoir longuement attisé la passion du duc et avoir exalté les résistances qu'il prétendait rencontrer, Lorenzo, sous le prétexte d'un rendez-vous enfin consenti, attirait chez lui le duc seul, sans escorte, et l'assassinait le 6 janvier 1537, aidé d'un sbire entièrement à sa dévotion. Lorenzo ne profita point de son crime; pris de terreur, il alla d'une traite jusqu'à Venise, ne songeant qu'à se mettre hors de portée et abandonnant le pouvoir auquel il avait droit. A Florence, en l'absence du meurtrier passé pourtant à l'état de héros sauveur, le conseil, composé d'âmes damnées des Médicis, nomma à l'unanimité comme chef de l'État le jeune Cosme de Médicis, âgé de dix-huit ans, fils de ce Jean des Bandes Noires, créateur de la célèbre infanterie de ce nom si populaire à Florence (1537).
Cosme, à ce moment, offrait toutes les garanties à ceux qui l'élevaient au pouvoir; sa jeunesse, son inexpérience leur semblaient des gages auxquels ses goûts paraissaient en ajouter d'autres. Il avait toujours vécu à la campagne, occupé uniquement à la chasse et à la pèche; on le croyait facile à conduire et à gouverner; aussi la surprise fut-elle extrême quand il montra une ambition effrénée et une volonté de fer pour n'en agir qu'à sa tête. Ayant obtenu de Charles-Quint la reconnaissance de ses droits, Cosme prit possession du pouvoir, mais ce ne fut qu'en 1569 qu'il prit officiellement pour lui et pour sa descendance le titre de grand-duc et de prince souverain. Il ne rencontra aucune opposition à ses ambitieuses visées, tant il avait su se défaire de ses ennemis par l'exil ou la mort, et, comme rien ne l'arrêtait, il faisait assassiner les derniers Lorenzaccio et Soderini à Venise où ils s'étaient réfugiés.
Sa domination bien établie, Cosme écarta des affaires avec une rare habileté tous ceux dont un conseil aurait pu le gêner et, sans scrupule, se débarrassa de toute entrave, sans qu'il put jamais être accusé positivement d'y avoir trempé les mains. Personne ne sut user comme lui de la confiscation; il avait une police inquisitoriale et, par des lois féroces, il interdisait jusqu'à la liberté de penser.