El continuador de la obra de Sebastián Gaboto fué D. Pedro de Mendoza, noble caballero español que había logrado no poca fama en la guerra de Italia. Hallándose en Toledo, a 21 de mayo de 1534, el Rey mandó tomar el asiento y capitulación siguiente: «1.º Primeramente os doy licenzia y facultad para que por Nos y en nuestro nombre y de la Corona Real de Castilla podais entrar en el dicho Río de Solís que llaman de la Plata, hasta la mar del Sur, donde tengais doscientas leguas de luengo de costa de gobernazion que comience desde donde se acaba la gobernazion que tenemos encomendada al mariscal don Diego de Almagro hasta el Estrecho de Magallanes, y conquistar y poblar las tierras y provincias que oviese en las dichas tierras. 2.º Item entendiendo ser cumplidero al servicio de Dios y nuestro, y por honrar nuestra persona y por vos hazer merced, prometemos de vos hazer nuestro gobernador y capitan general de las dichas tierras y provincias y Pueblos del Río de la Plata, y en las dichas dozientas leguas de costa del mar del Sur que comienzan desde donde acaban los límites que como dicho es tenemos dado en gobernacion al dicho Mariscal Don Diego de Almagro, por todos los días de nuestra vida con salario de dos mill ducados de oro en cada un año y dos mill de ayuda de costas...»[223].
El Emperador dió orden al conde D. Fernando de Andrada, asistente de Sevilla; al conde de Gelves, alcaide de las Atarazanas, y a los oficiales de la Casa de Contratación para que la armada se dispusiera a salir a la mayor brevedad. Tan rápido se hizo el apresto que Mendoza salió de la barra de Sanlúcar el 1.º de septiembre de 1535 al frente de una expedición compuesta—según Herrera—de 11 navíos con 800 hombres[224]. Algunos cronistas dicen que la expedición se componía de 14 naves que llevaban a bordo 2.500 castellanos y 150 alemanes.
Penetró Mendoza en el Río de la Plata y cuéntase que en el momento de pisar la tierra, el capitán Sancho García exclamó: ¡Qué buenos aires se respiran en esta tierra! En lucha los castellanos con los indios (bilelas, lules, agoyas, tobas, abipones, calchaquíes y otros), fueron muertos muchos de los primeros, entre ellos D. Diego de Mendoza y D. Pedro de Benavides, hermano aquél y sobrino éste del jefe de la expedición. Pasado poco tiempo (2 febrero 1536), Mendoza echó los cimientos de una población a la que dió el nombre de Santa María de Buenos Aires. Los indios querandís, rivales en fiereza a los charrúas, comenzaron a hostilizar a los nuevos pobladores, negándoles los víveres y diezmando a la guarnición. Deseando Mendoza encontrar sitio más hospitalario, dispuso que Juan de Ayolas se dirigiese más al Norte, siguiendo los pasos de Gaboto. Así lo hizo el intrépido capitán, quien luego fundó una fortaleza, origen de la ciudad de la Asunción (1536.)
Mientras Mendoza, desalentado y enfermo, regresaba á España, en cuya travesía hubo de morir, Ayolas, dejando a Martínez de Irala en el fuerte de la Asunción, se internó en los bosques del Chaco con 200 soldados, llegando hasta la frontera del Perú; pero a su vuelta fué sorprendido por los salvajes y muerto con todos los suyos.
Por muerte de Ayolas, se encargó interinamente del gobierno el capitán Irala; mas habiendo llegado de España Alonso de Cabrera, con el nombramiento de Gobernador para el caso en que faltase el propietario, tomó dicho Cabrera las riendas del poder. Dispuso despoblar Buenos Aires, trasladando sus habitantes a las orillas del Paraguay, en cuyos sitios los indígenas eran menos belicosos.
Conocedor el Rey de los sucesos ocurridos en la colonia, dió el título de Adelantado a Alvar Núñez Cabeza de Vaca, y cuyas capitulaciones se hicieron, al tenor de las de D. Pedro de Mendoza, el 18 de marzo de 1540. Alvar Núñez salió de Sanlúcar el 2 de noviembre de 1540 y llegó a la Asunción el 11 de marzo de 1542. Nombró maestre de campo a Irala. Alvar Núñez por un lado e Irala por otro, realizaron expediciones que no dejaron de ser útiles. Una revolución dirigida por el contador Felipe Cáceres acabó con su gobierno. Los conjurados penetraron (25 abril 1544) en la casa del Adelantado y lo redujeron a prisión. En seguida confiaron el mando de la colonia a Martínez de Irala, al mismo tiempo que mandaban a España al Adelantado.
Martínez de Irala puso orden en la colonia y peleó valerosamente con los indígenas. Emprendió una expedición al Perú y allí solicitó de La Gasca la confirmación del cargo que desempeñaba. A su vuelta al Paraguay tuvo que luchar con los parciales de Alvar Núñez Cabeza de Vaca, que se habían hecho dueños del poder. La corte confirmó a Irala en el gobierno del Paraguay, sorprendiéndole la muerte en 1557.
«Tan sabio era y astuto y cauteloso
en su trato y vivienda nuestro Irala,
que no tiene algun hombre del quexoso