Dès l'avènement de Henri II au trône, les persécutions contre les huguenots avaient commencé avec une fureur jusqu'alors inconnue. Sous l'inspiration des Guise, du connétable de Montmorency et de la nouvelle duchesse de Valentinois, de toutes parts on élevait des potences et des bûchers, le sang coulait à flots.
«Ce n'est pas, dit un auteur calviniste, que la favorite fut animée d'un bien grand zèle pour la religion catholique, mais la duchesse d'Etampes avait protégé la religion réformée, et cela seul avait déterminé Diane de Poitiers à faire précisément le contraire. De plus, elle et ses infâmes complices se partageaient les dépouilles de tous les martyrs de leur croyance, innocentes victimes dont on confisquait les biens.»
L'acharnement de Diane de Poitiers contre les huguenots est véritablement incroyable. Non contente d'ordonner des supplices, il lui arriva quelquefois d'assister aux interrogatoires, et d'accabler des injures les plus véhémentes les malheureux que, devant elle, on soumettait à la torture. Ainsi, suivant J. Crespin, dans l'affaire du tailleur du roi, «elle voulut elle-même assister au jugement et en dire sa râtelée.»
Y avait-il «quelque brûlement,» elle s'en réjouissait longtemps à l'avance, et y assistait toujours avec le roi. Accoudée à quelque fenêtre, la tête appuyée sur l'épaule de son amant, heureuse, souriante, elle regardait brûler les hérétiques. Les jours de bûcher étaient jours de fête pour la cour.
Il s'est cependant trouvé des poëtes pour chanter ces fureurs de Diane de Poitiers:
Sur tout, vous avez soin
De Dieu, de son Église,
De vous repoulsant bien loin
Toute malice et feintise.
Par la toute-puissance de la favorite, le cardinal de Lorraine, Charles, était comme le véritable roi de France. A chaque amant de la maîtresse royale, il fallait une part du pouvoir: le peuple murmurait et son indignation s'exhalait en épigrammes. Un jour, Henri II, en se mettant à table, trouvait ce quatrain sous son couvert:
Sire, si vous laissez comme Charles désire,
Comme Diane veut, par trop vous gouverner,
Fondre, pétrir, mollir, refondre, retourner,
Sire vous n'êtes plus, vous n'êtes plus que cire.
Ces vers irritaient le roi, mais ne lui donnaient pas le courage d'être le maître; il ne pouvait se «déguiser.»
Le connétable de Montmorency avait peut-être plus de pouvoir que le cardinal de Lorraine. Ses maladresses et son incapacité ne diminuaient pas son influence. Diane le soutenait. Il s'était fait battre, puis il était tombé aux mains de l'ennemi. Mais, du fond de sa prison, il tenait encore une des ficelles qui faisaient mouvoir Henri II. Le roi écrivait au connétable captif pour l'informer de tout ce qui se passait à la cour, pour lui dire ses griefs contre les Guise, qui parfois lui faisaient peur, enfin pour le consulter. Diane était de moitié dans la correspondance. «Le monarque tantôt servait à cette dame de secrétaire, tantôt lui cédait, puis reprenait la plume, comme on peut s'assurer par quelques lettres, conservées à la Bibliothèque, qui sont de deux écritures, et se terminent ainsi: