Ad ogni modo Cosimo I era ben lontano dal volere religiosamente osservare il trattato che aveva conchiuso; egli non poteva mantenersi sul trono, a dispetto dell'odio di tutti i suoi sudditi, senza essere spalleggiato da estera potenza; onde gli era impossibile di conservarsi neutrale tra la Francia e l'impero. Al servigio della Francia vedeva ricolmo di onorificenze Pietro Strozzi, figliuolo di quel Filippo ch'era perito nelle sue prigioni. Pietro, favoreggiato dalla regina Catarina de' Medici sua cugina germana, andava non pertanto assai più debitore della sua fortuna al proprio valore ed al singolare suo ingegno; era maresciallo di Francia e luogotenente del re in Italia, e non aveva altro più ardente desiderio che quello di balzare Cosimo I dall'usurpato suo trono. Cosimo non poteva dunque fare a meno di non attaccarsi al contrario partito, e di non assecondare l'imperatore; e benchè fosse stato più volte ingannato dai ministri di Carlo V; benchè fosse stato strascinato in enormi spese per la difesa di Piombino, che poi questo monarca gli aveva ritolto senza verun compenso, dopo averglielo dato; benchè si aspettasse d'avere lo stesso trattamento quando riuscisse a conquistare Siena a proprie spese; risolse nulladimeno di entrare in guerra, di sostenerne tutto il peso, e di prendere in oltre sopra di sè la vergogna di cominciarla con un tradimento[164].
I Sienesi si riposavano tranquillamente sul trattato fatto con Cosimo I, ed improvvidi ad esempio de' Francesi, loro alleati e loro ospiti, non pensavano che a godersi il presente senza apparecchiare i mezzi di difesa per l'avvenire. Intanto Cosimo faceva guardare severamente i suoi confini, onde niuno potesse dare ai Sienesi notizia de' suoi apparecchj; assoldava nuove genti, poneva in movimento le sue milizie e dava ordine ad ogni corpo della sua armata di trovarsi il 26 gennajo del 1554 a Poggibonzi, ultimo castello dello stato fiorentino sulla strada di Siena. Cosimo non prendeva giammai egli stesso il comando delle sue truppe, e nominò supremo comandante di queste Gian Giacomo Medici, o Medichino, da prima conosciuto sotto il nome di castellano di Musso, poi di marchese di Marignano, uomo intraprendente, e non pertanto cauto, perseverante, crudele, e che risguardavasi come uno de' migliori generali dell'imperatore. Nello stesso tempo, per lusingare la di lui vanità, finse Cosimo di trovare tra i Medici di Milano e quelli di Firenze un parentado che mai non aveva esistito[165].
Il 27 gennajo del 1554 il territorio sienese doveva contemporaneamente essere attaccato su tutti i punti; ma le dirotte piogge che caddero la notte sospesero tutti gli attacchi ad eccezione di quello del marchese di Marignano. Essendosi questi partito da Poggibonzi due ore prima di notte con quattro mila fanti e trecento cavaleggieri, arrivò senz'essere conosciuto fino alla porta di Siena, detta Camullia, e prese d'assalto il bastione destinato a difenderla, ch'era stato lasciato in piedi quando il popolo, scacciando gli Spagnuoli, aveva spianata la fortezza eretta da don Diego di Mendoza[166].
Il cardinale di Ferrara, don Ippolito d'Este, che risiedeva in Siena a nome del re di Francia, erasi lasciato ingannare dalle carezze e dalle adulazioni di Cosimo I, e, credendo di non dover nulla temere da lui, passava il tempo in continue feste. Trovavasi al ballo nell'istante in cui fu sorpresa porta Camullia, ed i Sienesi poterono trattenerlo a stento in città quando n'ebbe avviso. Ma siccome questi opposero una vigorosa resistenza al Marignano, e gli vietarono di penetrare in città, il cardinale di Ferrara si rassicurò, e subito dopo Pietro Strozzi, che in allora visitava Grosseto, Massa, Porto Ercole e le altre fortezze della Maremma, rientrò in Siena, e la pose in migliore stato di difesa. Il Marignano credette cosa imprudente l'aprire le sue batterie contro le mura di Siena, coperte di buona artiglieria e difese da numerosa guarnigione, e giudicò più conveniente di bloccare la città. I raccolti del precedente anno erano stati distrutti dalla guerra, e sembrava facile il distruggere altresì quelli dell'anno che cominciava. La città, sorpresa da inaspettato attacco, non aveva potuto fare grandi approvvigionamenti, ed il Marignano, prendendo successivamente i castelli che signoreggiavano tutte le strade che conducono a Siena, lusingavasi d'impedire che vi si recassero vittovaglie da esteri paesi[167].
Le truppe spagnuole e tedesche, che dall'imperatore erano state promesse a Cosimo I, arrivarono le une dopo le altre quando era già cominciata la guerra, e l'armata sotto Siena contò in breve ventiquattro mila fanti e mille cavalieri. Dall'altro canto arrivarono pure a Pietro Strozzi, o per mare, o a traverso allo stato romano truppe francesi o al soldo della Francia; ma queste erano sempre in minor numero che quelle che giugnevano al Marignano, onde questi, a seconda del suo piano di campagna, potè dare principio all'attacco de' castelli del territorio sienese. Il primo che prese fu l'Ajuola, i di cui abitanti si arresero a discrezione dopo averlo valorosamente difeso. Il Marignano li fece appiccare quasi tutti, dichiarando che riservava lo stesso trattamento a tutti coloro che aspetterebbero in una rocca da nulla il primo colpo della sua artiglieria[168]. Ma questa barbarie non ebbe altro risultamento che quello di accrescere gli orrori della guerra; i contadini sienesi con una costanza degna di miglior sorte, mostraronsi sempre irremovibili nella loro fedeltà verso la patria, qualunque si fosse il governo della medesima. Turrita, Asinalunga, la Tolfa, Scopeto e la Chiocciola opposero la medesima resistenza e provarono lo stesso trattamento. Un generale, che si piccava di bravura e di lealtà, diede ovunque in mano ai carnefici quegli uomini valorosi cui altro non poteva rimproverare che la loro fedeltà ed il loro valore[169].
Dal canto loro i Sienesi ebbero alcuni vantaggi che sostennero la loro costanza. In sul declinare di marzo il Marignano aveva mandato il suo generale di fanteria, Ascanio della Cornia, con Ridolfo Baglioni a Chiusi, che, secondo la promessa di alcuni traditori, doveva essergli consegnato. Ma i traditori, ch'egli credeva di avere sedotti, lo avevano ingannato; Ascanio della Cornia fu fatto prigioniero, il Baglioni fu ucciso, e la loro truppa, che ammontava a più di quattro mila uomini, fu interamente distrutta[170]. Ma Cosimo I si affrettò di somministrare altri fondi per fare nuove leve di soldati e riparare questa perdita. Poi ch'ebbe ricevuti alcuni rinforzi, il Marignano continuò l'assedio e l'incendio delle terre murate dello stato di Siena. Prese successivamente i castelli di Belcaro, Lecceto, Monistero, Vitignano, Ancajano e Mormoraja. Ogni terra gli costò ostinate pugne, ed ogni terra fu trattata con eguale barbarie; parte degli abitanti fu mandata al supplicio, tutte le messi immature distrutte, e guastate tutte le campagne[171].
Estrema era la desolazione del territorio sienese, gli ajuti della Francia tardi ed insufficienti, e la sorte della guerra che nello stesso tempo trattavasi in Fiandra era contraria ad Enrico II. Nondimeno le speranze dei Sienesi e quelle dello Strozzi venivano ravvivate dall'odio universale che i Fiorentini portavano alla casa de' Medici. Ovunque due Fiorentini si scontrassero, fuori del dominio di Cosimo, essi riconoscevansi tosto per le maledizioni che scagliavano contro il tiranno. Coloro che il commercio aveva adunati a Roma, a Lione, a Parigi, aprivano soscrizioni per mandare danaro a Pietro Strozzi, onde ajutarlo a scuotere il vergognoso giogo che opprimeva la loro patria[172].
Sapendo Pietro Strozzi che si adunavano alla Mirandola alcuni corpi di truppe francesi, egli risolse di aprire loro la strada di Siena. Uscì l'undici di giugno dalla città assediata con circa sei mila uomini[173]; passò l'Arno a Pontedera, e si avanzò, per la macchia di Cerbaia, verso lo stato di Lucca, che poi attraversò. Colà infatti ricevette i promessigli rinforzi di truppe che avevano tenuta la strada di Pontremoli; ma la flotta francese, che nello stesso tempo doveva giugnere a Viareggio, non comparve; essa fu ritardata più di quaranta giorni, ed il priore Strozzi, fratello di Pietro, che stava aspettandola con due galere, fu ucciso presso Scarlino. Due dì dopo la morte del gran priore, Biagio di Montluc, che Enrico II aveva scelto per comandare a Siena, venne a sbarcare a Scarlino con dieci compagnie francesi ed i tedeschi di Giorgio di Ruckrod, che di là passarono a Siena[174].
La spedizione del maresciallo Strozzi più avere non potendo quel successo che egli ne aveva sperato, quando aveva creduto di tener solo la campagna e di assediare Firenze coll'ajuto delle truppe che dovevano essergli condotte dalla flotta, egli ripassò l'Arno colla medesima rapidità e felicità con cui l'aveva guadato la prima volta, e ricondusse la sua armata a Casoli, nello stato di Siena[175].
Non pertanto la spedizione dello Strozzi aveva sparso il terrore in tutti i partigiani del duca in Toscana, e pareva promettere i più felici risultamenti. Il Marignano, che lo aveva seguito con tutta l'armata dell'assedio, soprappreso da panico terrore, erasi ritirato da Pescia verso Pistoja; e già stava in sul punto di abbandonare anche Pistoja come aveva fatto Pescia[176]. La fertile provincia di Val di Nievole si dichiarò pel partito dello Strozzi e della repubblica; i castelli di Monte Catini e di Monte Carlo avevano ricevuto guarnigione francese, e l'ultimo sostenne non molto dopo un assedio di più mesi; finalmente l'allontanamento delle due armate in tempo del raccolto avrebbe dato opportunità agli abitanti di Siena di fare grossi approvvigionamenti di vittovaglie, se avessero saputo approfittarne[177].