Cuando Juan de Garay, que ya se había cubierto de gloria peleando con el charrúa, asumió el mando de la colonia en el año 1576, se dispuso a mayores empresas. El 11 de junio de 1580 (sábado, día de San Bernabé), ante escribano y presentes justicias e regidores y mucha gente, estando—dice el citado Garay—en este puerto de Santa María de Buenos Aires, que es en la provincia del Río de la Plata, intitulada la Nueva Vizcaya, e fundo en el dicho asiento e puerto una ciudad, la cual pueblo con los soldados y gente que al presente tengo, e e traido para ello, la yglesia de la cual pongo su advocacion de la Santísima Trinidad, la cual sea e ha de ser yglesia mayor e parroquial, contenida y señalada en lata que tengo fecha de la dicha ciudad, y la dicha ciudad mando se intitule la ciudad de la Trinidad... El capitán Juan de Garay «en señal de posesion, echó mano a su espadon y cortó yerbas y tiró cuchilladas...»[239]. Garay levantó la nueva ciudad casi en el mismo sitio que D. Pedro de Mendoza fundó a Santa María de Buenos Aires, y que fué despoblada por su sucesor. Se abrieron los primeros fosos y empalizadas en el promontorio, cubierto de un bosque de espinos y algarrobos, donde a la sazón se encuentra la Casa Rosada del Gobierno nacional. Desmontado el bosque y comenzadas las edificaciones, pronto se pusieron de manifiesto las muchas ventajas comerciales y marítimas del sitio elegido por Juan de Garay. Capitán tan ilustre repartió solares a sus compañeros, señaló sitio para la iglesia y nombró cabildo. Estaba fundada la ciudad intitulada Santísima Trinidad del puerto de Buenos Aires.
Después castigó a los belicosos querandíes, como en la opuesta orilla del Río de la Plata había castigado a los charrúas. Pasados cuatro años (1584) salió a visitar sus provincias con dirección a la Asunción, y como Solís en el Uruguay, y como Ayolas en el mismo Paraná, fué inmolado con 40 de sus compañeros por un grupo de indios mañuaés. Centenera escribe:
«Garay fué de prudencia siempre falto,»
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Con el gobierno de Juan de Garay se puede dar fin a la conquista de las provincias argentinas.
Por lo que atañe a la Patagonia, aquí sólo diremos que se exploraron primeramente las costas orientales y meridionales, desde el cabo de San Antonio (al mediodía del grande desagüe de la Plata) hasta el cabo de la Victoria inclusive (en la extremidad más occidental del Estrecho de Magallanes.)
Del Chaco no se tuvieron noticias exactas hasta últimos del siglo xviii. Sólo se sabía que el país era extenso, seco y arenoso, y que los indígenas vivían en aquella dilatada tierra en estado de barbarie.
Al estudiar el Paraguay y el Uruguay debemos no olvidar, que, durante el período de la colonización, la historia de aquellos países es la misma que la de la tierra conocida hoy con el nombre de República Argentina. Ambos países formaban parte de las provincias argentinas. Recordaremos, sin embargo, que así como los querandís poblaban la Argentina, los guaranís se hallaban en el Paraguay y los charrúas en el Uruguay. Según las crónicas, dichas razas eran salvajes. Añadiremos a lo expuesto que habiendo fundado Sebastián Gaboto la fortaleza que llamó Sancti Spíritus, su sucesor Pedro de Mendoza dispuso que Juan de Ayolas continuara en el Paraguay la obra comenzada por dicho Gaboto. En efecto, Ayolas remontó el río Paraná con tres bergantines y sufrió grandes trabajos a causa de los vientos y las lluvias. Perdió un bergantín y quedaron mal parados los otros. Aunque parte de la expedición saltó a tierra, unos y otros, lo mismo los de tierra que los del río, padecieron horriblemente «por la falta extrema de comida, que si Dios Nuestro Señor no los socorriera, veían claramente su muerte...»[241].
Continuó su camino, encontrando frío recibimiento de parte de algunos indios y ruda oposición de parte de otros. Viendo D. Pedro de Mendoza que no volvía Ayolas, envió en su seguimiento al capitán Juan de Salazar de Espinosa. Ayolas, no sin pelear con los caciques Lambare y Nandúa en el valle de Guarnipitán, pudo gozar de alguna tranquilidad. Allí mismo echó los cimientos de la capital. «Fundóla—dice la Descripción universal de las Indias—Juan de Salazar, capitán del gobernador D. Pedro de Mendoza, por el año de 36 o 37[242], con poder de Juan de Ayolas, que quedó en lugar de Mendoza, en el sitio y comarca donde ahora está, que antiguamente se llamaba Alambaré, del nombre de un cacique principal de la comarca que comunmente se llama ahora Paraguay, por el río que pasa por ella, y llamóla del nombre que ahora tiene por haberse comenzado a fundar el día de la Asunción.» Continuó Ayolas remontando el Paraguay, fondeó en la Candelaria y al frente de unos 300 españoles—pues como jefe de las embarcaciones dejó a Domingo Martínez de Irala—, emprendió (12 febrero 1537) un viaje al Perú por tierra, atravesando las provincias de Chiquitos y de Santa Cruz de la Sierra, retrocediendo luego y siendo, por último, asesinado por los indios guanaes, como antes se dijo.
Durante el siglo xvi el Gobierno de la Asunción ejerció jurisdicción en todo el Río de la Plata.