Envió desde allí á Nuflo de Chaves, con una solicitud á La Gasca para que lo confirmase en el gobierno, regresando al Paraguay donde á tiempo develó la usurpación de Abreu. Poco después llegó Chaves, el cual, con aquel doble viaje, acababa de realizar la expedición más notable que haya salido del Paraguay.
Los indios de la Guayra, duramente explotados por los portugueses que los esclavizaban, reclamaron la protección de Irala, cuyo renombre se extendía ya hasta por la selva como un símbolo de prestigio y de justicia. Acudió el conquistador á la demanda, recorrió entera la región, estableciendo el dominio español sobre blancos é indios, y abriendo de este modo una vía de comunicación entre su sede y tan lejana barbarie.
Hasta entonces la conquista se había realizado sin ninguna intervención religiosa, de tal modo que recién al año siguiente de esta última expedición (1555) llegó al Paraguay su primer obispo. El territorio ocupado después por el Imperio Jesuítico, estaba completamente abierto ya, no obstante su extensión, con más otras regiones adonde no llegó nunca la expansión misionera.
Dos nuevas expediciones á la Guayra, acabaron de cimentar en ella el prestigio español: una de Chaves, que buscaba salida al Atlántico por la costa del Brasil, y otra de Ruy Díaz Melgarejo, que fundó en dicha provincia la Ciudad Real.
No se había perdido la idea de buscar comunicación directa al Perú, é Irala envió á Chaves nuevamente con tal objeto. Ya no volvería á verle, pues murió antes de su regreso, pero aquel infatigable conquistador había cumplido sus órdenes con éxito extraordinario. Recorrió en efecto la provincia entera de Chiquitos, y el Matto Grosso, verdaderas regiones de leyenda cuyo acceso requería una constancia rayana en obstinación y una intrepidez realzada al heroísmo. Ya sobre la actual Bolivia, encontróse con Manso que venía del Perú. Disputaron sobre la posesión de aquellas tierras, que le fueron adjudicadas por el Virrey, y á su regreso fundó la ciudad de Santa Cruz.
Gonzalo de Mendoza, heredero de Irala, murió un año después de su elevación al gobierno, nombrándose en su reemplazo á Ortiz de Vergara, con quien empezó la serie de motines y golpes de mano, en que la ingerencia política del clero se manifestó por primera vez.
Entretanto, habían continuado las fundaciones, hasta alcanzar, sumadas con las trece antedichas, el número de veintiocho en setenta y cuatro años.
Azara, en su lista de pueblos, incluye como laicas las trece primeras reducciones de la Guayra; pero no creo que deba imputarse este error á malevolencia sectaria con objeto de desprestigiar la obra jesuítica; pues de Moussy, en quien ya no cabe igual sospecha, lo reprodujo. Es verosímil suponer una confusión con las trece fundaciones efectuadas en los años de 1536-38 por Ayolas é Irala, dado que la coincidencia del número, tanto en las jesuíticas como en las laicas, pudo motivar el trastrueque; y sin que esta explicación pretenda discutir el sectarismo de Azara, indudable por otra parte.
La conquista laica tuvo en Irala su dechado. Hombre de gobierno ante todo, su administración dió la pauta á las organizaciones futuras, que nunca pudieron sobrepujarla. Su intrepidez y su rectitud, combinadas en admirable equilibrio, le conciliaron el afecto de los indios y de los blancos. Legislador, sus reglamentos gobernaron por muchos años el Paraguay, siendo ahora mismo, y en atención á la sociedad que organizaron, un modelo de sabiduría política. Incansable en sus empresas, dilató los límites de su territorio hasta puntos que no fueron alcanzados sino doscientos cincuenta años después; y sus expediciones al Perú, no han vuelto á repetirse.
Más político que Álvar Núñez, cuya rigidez se volvió odiosa ante sus compañeros, él supo conciliar la severidad con la blandura, hasta hacerse idolatrar por los soldados, que le veneraban como á un padre, y amar por los indios como á un justiciero protector.