L'empereur n'avait payé si cher sa délivrance que pour s'engager immédiatement après dans un nouvel embarras. Les affaires de religion de la Bohême avaient été renvoyées à la prochaine diète: elle s'ouvrit en 1609. Les états demandaient la liberté du culte, telle qu'elle avait existé sous le dernier empereur, un consistoire particulier, la cession de l'université de Prague, et la permission de nommer dans leur sein des défenseurs, ou protecteurs de leur liberté. Rodolphe s'en tint à sa première réponse: le parti catholique avait enchaîné toutes les résolutions du timide empereur. Si réitérées et si menaçantes que fussent les représentations des états, il persista dans sa première déclaration de n'accorder rien au delà des anciennes conventions. La diète se sépara sans avoir rien obtenu, et ses membres, irrités contre l'empereur, convinrent entre eux de se réunir à Prague, de leur propre autorité, pour aviser eux-mêmes à leurs intérêts.
Ils parurent en grand nombre à Prague, et les délibérations suivirent leur cours, sans égard à la défense de l'empereur, et presque sous ses yeux. La condescendance qu'il commença à montrer ne fit que leur prouver combien ils étaient redoutés et accrut leur audace: sur l'article principal, Rodolphe resta inébranlable. Alors ils exécutèrent leurs menaces, et prirent sérieusement la résolution d'établir eux-mêmes en tous lieux le libre exercice de leur culte et d'abandonner l'empereur dans sa détresse, jusqu'à ce qu'il eût approuvé cette mesure. Ils allèrent plus loin, et se donnèrent eux-mêmes les défenseurs que l'empereur leur refusait. On en désigna dix de chacun des trois ordres; on résolut de mettre sur pied au plus tôt une force militaire, et le comte de Thurn, principal instigateur de cette révolte, fut nommé général major. Des actes si sérieux obligèrent enfin Rodolphe de céder: les Espagnols eux-mêmes le lui conseillèrent. Dans la crainte que les états, poussés à bout, ne se donnassent enfin au roi de Hongrie, il signa la fameuse lettre impériale ou de Majesté que les Bohêmes ont invoquée, sous les successeurs de Rodolphe, pour justifier leur soulèvement.
Par cette lettre, la confession de Bohême, que les états avaient présentée à Maximilien, acquérait absolument les mêmes droits que l'Église catholique. Les utraquistes (c'est par ce nom que les protestants de Bohême continuaient de se désigner) obtiennent l'université de Prague et un consistoire particulier, entièrement indépendant du siége archiépiscopal de Prague. Ils conservent toutes les églises qu'ils possèdent dans les villes, les villages et les bourgs, à la date de la publication de la lettre; et, s'ils veulent encore en bâtir de nouvelles, cette faculté ne sera interdite ni à l'ordre des seigneurs et chevaliers ni à aucune ville. C'est sur ce dernier article de la lettre impériale que s'éleva plus tard la querelle qui mit l'Europe en feu.
La lettre impériale faisait de la Bohême protestante une sorte de république. Les états avaient appris à connaître la force que leur donnaient la constance, l'union et le bon accord dans leurs mesures. Il ne restait guère plus à l'empereur qu'une ombre de sa puissance souveraine. L'esprit de révolte trouva un dangereux encouragement dans la personne des soi-disant protecteurs de la liberté. L'exemple et le succès de la Bohême étaient un signal séduisant pour les autres États héréditaires de l'Autriche, et tous se disposaient à arracher les mêmes priviléges par les mêmes moyens. L'esprit de liberté parcourait une province après l'autre, et, comme c'était surtout la discorde des princes autrichiens que les protestants avaient mise à profit si heureusement, on se hâta de réconcilier l'empereur avec le roi de Hongrie.
Mais cette réconciliation ne pouvait être sincère. L'offense était trop grave pour être pardonnée, et Rodolphe continua de nourrir dans son cœur une haine inextinguible contre Matthias. Il s'arrêtait avec douleur et colère à la pensée que le sceptre de Bohême devait aussi venir à la fin dans cette main détestée; et la perspective n'était guère plus consolante pour lui, si Matthias mourait sans héritier. Alors Ferdinand, archiduc de Grætz, qu'il aimait tout aussi peu, devenait le chef de la famille. Pour l'exclure, ainsi que Matthias, du trône de Bohême, il conçut le dessein de faire passer cet héritage au frère de Ferdinand, l'archiduc Léopold, évêque de Passau, celui de tous ses agnats qu'il aimait le plus et qui avait le mieux mérité de sa personne. Les idées des Bohêmes sur leur droit de libre élection au trône, leur penchant pour la personne de Léopold, semblaient favorables à ce projet, pour lequel Rodolphe avait consulté sa partialité et son désir de vengeance plus que l'intérêt de sa maison. Cependant, pour accomplir son dessein, il avait besoin de forces militaires, et il rassembla en effet des troupes dans l'évêché de Passau. Nul ne connaissait la destination de ce corps; mais une incursion soudaine qu'il fit en Bohême, par défaut de solde, et à l'insu de l'empereur, et les désordres qu'il y commit, soulevèrent contre Rodolphe tout le royaume. Vainement il protesta de son innocence auprès des états de Bohême: ils n'y voulurent pas croire. Vainement il essaya de réprimer la licence spontanée de ses soldats: il ne put s'en faire écouter. Supposant que ces préparatifs avaient pour objet la révocation de la lettre de Majesté, les défenseurs de la liberté armèrent toute la Bohême protestante, et Matthias fut appelé dans le pays. L'empereur, après que ses troupes de Passau eurent été expulsées, resta dans Prague, privé de tout secours. On le surveillait, comme un prisonnier, dans son propre château, et l'on éloigna de lui tous ses conseillers. Cependant, Matthias avait fait son entrée à Prague au milieu de l'allégresse, universelle, et, bientôt après, Rodolphe fut assez pusillanime pour le reconnaître roi de Bohême: sévère dispensation du sort, qui contraignit cet empereur de transmettre pendant sa vie, à son ennemi, un trône qu'il n'avait pas voulu lui laisser après sa mort! Pour comble d'humiliation, on le força de relever de toutes leurs obligations ses sujets de Bohême, de Silésie et de Lusace, par un acte de renonciation écrit de sa main. Il obéit, le cœur déchiré. Tous, ceux-là mêmes qu'il croyait s'être le plus attachés, l'avaient abandonné. Après avoir signé, il jeta par terre son chapeau, et brisa avec les dents la plume qui lui avait rendu ce honteux service.
Tandis que Rodolphe perdait l'un après l'autre ses États héréditaires, il ne soutenait pas beaucoup mieux sa dignité impériale. Chacun des partis religieux qui divisaient l'Allemagne s'efforçait toujours de gagner du terrain aux dépens de l'autre ou de se garantir contre ses attaques. Plus était faible la main qui tenait le sceptre impérial, et plus les protestants et les catholiques se sentaient abandonnés à eux-mêmes: plus devaient s'accroître la vigilance avec laquelle ils s'observaient réciproquement, et leur mutuelle défiance. Il suffisait que l'empereur fût gouverné par les jésuites, et dirigé par les conseils de l'Espagne, pour donner aux protestants un sujet d'alarmes et un prétexte à leurs hostilités. Le zèle inconsidéré des jésuites, qui, dans leurs écrits et du haut de leur chaire, jetaient du doute sur la validité de la paix de religion, excitait toujours plus la défiance des religionnaires, et leur faisait soupçonner dans la démarche la plus indifférente des catholiques des vues dangereuses. Tout ce qui était entrepris, dans les États héréditaires de l'empereur, pour limiter la religion évangélique éveillait l'attention de toute l'Allemagne protestante, et ce puissant soutien, que les sujets évangéliques de l'Autriche trouvaient ou se flattaient de trouver chez leurs coreligionnaires, contribuait beaucoup à leur audace et aux rapides succès de Matthias. On croyait dans l'Empire que la durée prolongée de la paix de religion n'était due qu'aux embarras où les troubles intérieurs de ses États héréditaires jetaient l'empereur: aussi ne se pressait-on nullement de le tirer de ces embarras.
Presque toutes les affaires de la diète de l'Empire demeuraient en suspens, soit par la négligence de Rodolphe, soit par la faute des princes protestants, qui s'étaient fait une loi de ne subvenir en rien aux besoins communs, tant qu'on n'aurait pas fait droit à leurs griefs. Ces griefs portaient principalement sur le mauvais gouvernement de l'empereur, sur la violation de la paix religieuse, et sur les nouvelles usurpations du conseil aulique de l'Empire, qui avait commencé sous ce règne à étendre sa juridiction aux dépens de la chambre impériale. Autrefois, les empereurs avaient prononcé souverainement par eux-mêmes dans les cas de peu d'importance, avec le concours des princes dans les cas graves, sur toutes les contestations qui s'élevaient entre les membres de l'Empire, et que le droit du plus fort n'avait pas terminées sans leur intervention; ou bien ils remettaient la décision à des juges impériaux, qui suivaient la cour. A la fin du quinzième siècle, ils avaient transféré cette juridiction souveraine à un tribunal régulier, permanent et fixe, la chambre impériale de Spire, et les membres de l'Empire, pour n'être pas opprimés par la volonté arbitraire de l'empereur, s'étaient réservé le droit d'en nommer les assesseurs et d'examiner les jugements par des révisions périodiques. Ce droit des membres de l'Empire, nommé le droit de présentation et de visitation, la paix de religion l'avait étendu aux membres luthériens, si bien que désormais les causes protestantes eurent aussi des juges protestants, et qu'une sorte d'équilibre parut exister entre les deux religions dans ce tribunal suprême de l'Empire.
Mais les ennemis de la réformation et des libertés germaniques, attentifs à tout ce qui pouvait favoriser leurs vues, trouvèrent bientôt un expédient pour détruire le bon effet de cette institution. Peu à peu, l'usage s'introduisit qu'un tribunal particulier de l'empereur, le conseil aulique impérial, établi à Vienne, et sans autre destination, dans l'origine, que d'assister l'empereur de ses avis dans l'exercice de ses droits personnels incontestés; un tribunal dont les membres, nommés arbitrairement par l'empereur seul et payés par lui seul, devaient prendre pour loi suprême l'intérêt de leur maître, pour unique règle l'avantage de la religion catholique, qu'ils professaient: que ce conseil, dis-je, exerçât la haute justice sur les membres de l'Empire. Beaucoup d'affaires litigieuses, entre des membres de différente religion, sur lesquelles la chambre impériale avait seule le droit de prononcer, ou qui, avant son institution, ressortissaient au conseil des princes, étaient maintenant portées devant le conseil aulique. Il ne faut pas s'étonner si les sentences de ce tribunal trahissaient leur origine, et si des juges catholiques et des créatures de l'empereur sacrifiaient la justice à l'intérêt de la religion catholique et de l'empereur. Quoique tous les membres de l'Empire semblassent intéressés à s'élever à temps contre un abus si dangereux, cependant les protestants, qu'il blessait plus sensiblement, se levèrent seuls (encore ne furent-ils pas unanimes) pour défendre la liberté allemande, qu'une institution si arbitraire attaquait dans ce qu'elle a de plus sacré, l'administration de la justice. Certes l'Allemagne n'aurait eu guère à se féliciter d'avoir aboli le droit du plus fort et institué la chambre impériale, si l'on eût encore souffert, à côté de ce tribunal, la juridiction arbitraire de l'empereur. Les membres de l'Empire germanique eussent fait bien peu de progrès, en comparaison des temps de barbarie, si la chambre impériale, où ils siégeaient à côté de l'empereur et pour laquelle ils avaient renoncé à leur ancien droit de princes souverains, avait dû cesser d'être une juridiction nécessaire. Mais, à cette époque, les esprits alliaient souvent les plus étranges contradictions. Alors, au titre d'empereur, légué par le despotisme romain, s'attachait encore une idée de pouvoir absolu, qui faisait avec le reste du droit public allemand le plus ridicule contraste, mais qui était néanmoins soutenue par les juristes, propagée par les fauteurs du despotisme et reçue par les faibles comme un article de foi.
A ces griefs généraux s'ajouta peu à peu une suite d'incidents particuliers, qui portèrent enfin les inquiétudes des protestants jusqu'à la plus vive défiance. A l'époque des persécutions religieuses exercées par les Espagnols dans les Pays-Bas, quelques familles protestantes s'étaient réfugiées dans la ville impériale catholique d'Aix-la-Chapelle, où elles s'établirent à demeure et augmentèrent insensiblement le nombre de leurs adhérents. Ayant réussi, par adresse, à faire entrer quelques personnes de leur croyance dans le conseil de la ville, les religionnaires demandèrent une église et l'exercice public de leur culte, et comme ils essuyèrent un refus, ils se firent raison par la force et s'emparèrent même de toute l'administration municipale. C'était pour l'empereur et tout le parti catholique un coup trop sensible de voir une ville si considérable au pouvoir des protestants. Toutes les représentations de Rodolphe et ses ordres de rétablir les choses sur l'ancien pied étant demeurés sans effet le conseil aulique mit la ville au ban de l'Empire, par une sentence qui ne reçut toutefois son exécution que sous le règne suivant.
Les protestants firent, pour étendre leur domaine et leur puissance, deux autres tentatives plus considérables. L'électeur de Cologne, Gebhard, né Truchsess de Waldbourg, conçut pour la jeune comtesse Agnès de Mansfeld, chanoinesse de Gerresheim, une violente passion, à laquelle Agnès ne fut pas insensible. Comme les yeux de toute l'Allemagne étaient fixés sur cette liaison, les deux frères de la comtesse, zélés calvinistes, demandèrent satisfaction de cette atteinte à l'honneur de leur maison, qui ne pouvait être sauvé par un mariage, tant que l'électeur demeurerait évêque catholique. Ils le menacèrent de laver cette tache dans son sang et celui de leur sœur, s'il ne renonçait aussitôt à tout commerce avec la comtesse ou ne lui rendait l'honneur devant les autels. L'électeur, indifférent à toutes les conséquences de sa démarche, n'écouta que la voix de l'amour. Soit qu'il eût déjà, en général, du penchant pour la religion réformée, soit que les charmes de son amante opérassent seuls ce miracle, il abjura la foi catholique et conduisit la belle Agnès à l'autel.