Élisabeth laissait Marie se livrer elle-même, se compromettre, légitimer l'arme perfide qui devait la frapper, et en même temps elle gagnait de Gray, le diplomate de Jacques VI.
M. de Gray était l'esprit le plus fin, le plus avisé, le plus insinuant, le caractère le plus double, le plus corrompu, relevé par des manières engageantes et polies, par un visage ouvert, un abord charmant et des saillies de gaieté qui ne dégénéraient jamais en épigrammes. Sous une légèreté apparente, sous un abandon joué, il avait une logique féroce, une persévérance invincible. C'était le plus aimable des courtisans, mais aussi le plus âpre des ambitieux, le plus hypocrite, le plus arrière-penseur des gentilshommes.
Les vieux ministres d'Élisabeth s'entendirent bientôt avec lui. Personnellement engagé envers la reine d'Angleterre, envers Burleigh et Walsingham, il repartit pour Édimbourg, résolu à trahir Marie Stuart, et à saper le traité d'association qui aurait rendu la liberté à cette infortunée princesse.
Sur ces entrefaites, Marie reçut l'ordre de quitter Wingfield pour Tutbury, dans le comté de Stafford. Toujours préoccupée d'amener Élisabeth à sanctionner un traité qui l'admettrait avec son fils au partage de l'autorité royale en Écosse ; de plus en plus soigneuse de la fléchir en lui obéissant et en la caressant, la pauvre prisonnière se soumit de bonne grâce à ce nouveau déplacement, malgré tous les inconvénients dont il la menaçait. Elle connaissait Tutbury, et elle redoutait cette demeure. C'était un affreux château, mal bâti, mal joint, lézardé de toutes parts, et moins bien meublé que les chaumières d'aujourd'hui. Toutefois, et quel que fût son dégoût de cette odieuse prison, Marie écrivit une lettre amicale à Élisabeth :
« Madame ma bonne sœur, pour vous complaire, comme je désire en toutes choses, je pars présentement pour m'acheminer à Tutbury. Preste à entrer en mon cosche, je vous bayse les mayns. »
Partie le 13 janvier 1585 de Wingfield, Marie arriva le lendemain à Tutbury.
Alors l'horreur de ce séjour la saisit. Elle pria Burleigh d'intercéder auprès de la reine d'Angleterre, afin qu'on réparât Tutbury. Elle demanda aussi ses chevaux restés à Sheffield, insistant sans cesse pour que son écurie fût transportée près d'elle : « Mon écurie, dit-elle, sans laquelle je suis plus prisonnière que jamays. » Elle écrivait lettres sur lettres, tantôt à Élisabeth, tantôt à lord Burleigh, tantôt à M. de Mauvissière. Elle voulait envoyer directement en Écosse un serviteur pour s'entendre avec son fils, et puis elle revenait aux incommodités de Tutbury, et puis elle sollicitait de nouveau « l'establissement d'une petite écurye de douze chevaulx, oultre mon coche, dit-elle, m'estant du tout impossible de pouvoir prendre l'air sans cela, d'aultant que je ne puis aller à pied cinquante pas ensemble. »
On lui refusa tout. On lui retint ses chevaux à Sheffield ; on la priva d'exercice ; on lui interdit l'aumône, les consolations de la charité, le soulagement des misères qui l'entouraient. On empêcha toute communication entre elle et son enfant, excepté celles qui devaient la désespérer. Ainsi, on lui remit avec empressement une lettre de Jacques VI, écrite sous l'impression de M. de Gray, dans laquelle le fils repoussait la mère de tout partage d'autorité, et ne lui accordait pas même une moitié de trône qu'elle réclamait, non certes pour l'occuper, mais afin d'obtenir par là sa liberté.
Cette conduite de son fils pénétra Marie Stuart de douleur. « Je suis si grievement offencée et navrée au cœur de l'impiété et ingratitude que l'on contrainct mon enfant à commectre contre moy, que s'il persiste en cela, j'invoqueray la malédiction de Dieu sur luy, et luy donneray, non-seulement la mienne, avec telles circonstances qui luy toucheront au vif, mais aussi le désériteray-je et donnerai-je mon droit (à la couronne d'Angleterre), quel qu'il soyt, au plus grand ennemy qu'il aye, avant que jamays il en jouisse par usurpation comme il fait de ma couronne, à laquelle il n'a aulcun droict, refusant le mien, comme je montreray qu'il confesse de sa propre main. »
La reine était abreuvée d'angoisses physiques et morales. On diminua ses serviteurs, on augmenta le nombre de ses espions. On reçut ses lettres et on ne daigna pas lui répondre. On l'isola dans son donjon délabré comme dans un tombeau. L'argent lui manqua, et sa table fut réduite à la plus vile économie. Elle écrivait à l'ambassadeur de France : « Pour vous dire encores plus librement, la nécessité me faisant en cela à mon grand regret passer la honte, je commence à estre fort mal servye pour ma personne propre, et sans aulcune considération de mon estat maladif qui m'oste quasi ordinairement tout appétit. »