Ce n'était pas sa propre cause, c'était celle de ses frères protestants qu'il voulait porter devant l'opinion publique.
Il se défendit en magistrat. Il se regardait comme tenu envers le dogme de son choix et la justice de son pays, de combattre jusqu'au bout et avec éclat pour la plus belle de toutes les libertés : la liberté religieuse. Il s'engagea dans le labyrinthe des ressources légales. Il avait été nommé successivement sous-diacre et diacre. Condamné à ces deux titres par l'officialité de Paris, il en appela comme d'abus au parlement, puis à l'archevêque de Sens, puis il s'adressa encore au parlement, puis au primat des Gaules, au cardinal de Tournon. Tous les degrés de juridiction parcourus, il s'enveloppa de sa toge et il se résigna tranquillement. Il avait disputé sa vie aux bourreaux, de texte en texte, sans concession, sans faiblesse, avec toutes les armes du droit et de l'expérience, comme ces capitaines dont parle Brantôme, qui défendaient une place confiée à leur honneur, malgré la famine, la peste, le feu des assiégeants, de poste en poste, de redoute en redoute, et qui ne la rendaient qu'après avoir brisé leurs épées, usé leur poudre, épuisé leurs balles sur la brèche ouverte et démantelée.
Les juges de du Bourg eux-mêmes furent ébranlés, attendris. Ils désiraient en secret qu'il déguisât sa foi seulement par son silence. Son avocat, qui connaissait leur émotion, le pressa de se taire. Du Bourg résista. Comme la parole lui avait été ôtée devant ses juges, rentré dans sa prison il écrivit et déclara sa confession conforme à celle de Genève. Cette constance le perdit. Ses juges étaient des commissaires du parlement auxquels il avait été livré, comme hérétique, par les tribunaux ecclésiastiques. Ils n'osèrent l'absoudre. Ils siégeaient à la Bastille où le prisonnier avait été conduit, et c'est là qu'ils prononcèrent sa sentence. Ils le condamnèrent au bûcher.
Du Bourg se réjouit du martyre et ne se démentit pas un instant. Il se soumit à la dégradation avec une ironie profonde. Pendant qu'on lui arrachait l'un après l'autre les habits de son ordre, qu'on abolissait autant qu'on le pouvait sur sa personne le caractère indélébile du sacrement en passant légèrement le tranchant du verre sur sa tonsure, il disait : « Je me félicite d'être dépouillé du signe de la Bête, afin de n'avoir plus rien de commun avec cet antechrist qu'on appelle le pape. »
Arrivé sur la place de Grève, son front devint serein, ses yeux brillèrent d'une douce flamme, et son sourire perdit toute expression amère. L'enthousiasme avait remplacé le sarcasme sur ses lèvres et dans sa physionomie. « Six pieds de terre pour mon corps et le ciel infini pour mon âme, voilà ce que j'aurai bientôt, » dit-il en se remettant à l'exécuteur. Le bourreau lui ayant passé la corde au cou et prononcé la terrible formule : Messire le roi vous salue, Anne du Bourg fut étranglé d'abord, puis brûlé, le 23 juillet 1559. Les catholiques applaudirent, mais les protestants, muets d'horreur, préparèrent leurs armes.
Les autres conseillers arrêtés avec Anne du Bourg, moins généreux que lui, se rétractèrent et n'encoururent que des peines temporaires ou des amendes.
Néanmoins, le seul supplice d'un aussi grand homme de bien, venant s'ajouter comme un sang de martyr à tous les griefs des protestants, fit déborder la coupe contenue de leur colère.
Un gentilhomme du Limousin, Godefroy de Barri, seigneur de la Renaudie, organisa une conspiration contre les Guise, ces tyrans du royaume, ces persécuteurs des réformés. Il résolut de s'emparer de la personne du jeune roi, de livrer les Lorrains au gibet, et d'appeler le prince de Condé à la direction des affaires. Le prince consentit à tout, et beaucoup de gentilshommes s'engagèrent dans cette périlleuse entreprise. De Chalosse devait commander les Gascons ; Mazères, les Béarnais ; Du Mesnil, les conjurés du Limousin et du Périgord ; Maillé de Brezé, ceux du Poitou ; la Chesnaye, ceux du Maine ; Sainte-Marie, ceux de la Normandie ; Cocqueville, ceux de la Picardie ; Maligny, ceux de l'Ile de France et de la Champagne ; Châteauvieux, les Provençaux et les Bordelais. Toutes ces bandes étaient destinées à s'avancer vers Blois, où le roi se trouvait avec la cour.
Averti par la trahison d'Avenelles, un avocat huguenot, ami de la Renaudie, le duc de Guise avait mené le roi de Blois à Amboise, place plus forte et plus facile à préserver d'un coup de main. Il prit des précautions militaires suffisantes pour vaincre les conjurés, sans les alarmer d'avance. Il les endormit pour les mieux envelopper. Un bruit sourd se répandit néanmoins que le duc était sur ses gardes. Inaccessible à toute crainte, la Renaudie persista. Soixante gentilshommes avaient juré de pénétrer de nuit dans Amboise, et trente de se glisser dans le château. Ces gentilshommes devaient livrer l'une des portes à la Renaudie et à ses huguenots. L'attaque de la ville était fixée au 16 mars (1560). Mais le duc de Guise veillait. Il fit murer la porte que les conjurés avaient marquée pour l'ouvrir à leurs amis. Il échelonna jusque dans la forêt d'Amboise des détachements dont il était sûr, et qui exterminèrent successivement presque tout ce qui se présenta en armes. Les rebelles portaient à leurs casques des pompons moitié blancs, moitié noirs, qu'ils avaient adoptés en signe de ralliement.
La Renaudie était à la tête d'une troupe d'élite. Il était épié par l'un de ses cousins, Pardaillan, qui commandait une compagnie de catholiques, et qui s'était embusqué dans le bois de Château-Regnault.