Le comte de Morton fut l'homme politique de cette conspiration. Lui seul peut-être sut toute l'étendue et toute la portée de son action. Il coopérait au meurtre de Riccio dans une vue personnelle, et aussi dans des desseins profonds de tribun aristocratique. Il sentait que par là il annulait la reine et ses alliés, les catholiques et le catholicisme ; il sentait qu'il allait redonner vigueur à la réforme en cimentant l'alliance anglaise, en rappelant les lords proscrits, en replaçant Murray à la tête du gouvernement, dont Darnley ne serait que la vaine décoration, le simulacre officiel.

Randolph et le comte de Bedford furent mis dans le secret. Ils annoncèrent d'avance le complot à Cecil et à leur souveraine Élisabeth.

Murray, de Grange, de Rothes et leurs amis, furent avertis et se réunirent sur les frontières d'Écosse.

Deux traités ou bands furent signés par le roi et par les conspirateurs. Ils se juraient amitié et solidarité dans l'exécution de cette grande entreprise, qui fut le triomphe cruel de la réforme sur l'Église, du parti protestant sur le parti catholique, de la noblesse et du peuple sur la reine et sa camarilla, de Knox et du Nord sur le pape et sur le Midi.

Le comte de Lennox, lord Ruthven, George Douglas, Lindsey, André Ker, étaient au premier rang des conjurés. Ils s'entendirent avec Darnley. Près de l'appartement de la reine, séparés d'elle par une simple cloison, ils prononcèrent la mort du favori.

Ce qu'il y eut de plus grave dans ces bands homicides, ce fut la participation de Knox. Consulté par les conjurés sur la légitimité de l'acte qu'ils allaient accomplir, il rassura leurs consciences déjà si hardies. L'esprit du rigide docteur souffla sur eux, non pour les détourner du crime, mais pour les y précipiter. Il les y prépara comme à une sainte entreprise, par la prière et par le jeûne. Dans l'emportement de son fanatisme, Knox se chargea de justifier le meurtre devant Dieu, et, l'autorisant de son approbation, il mit ainsi de sa main d'apôtre, à l'assassinat, le sceau religieux de son caractère et de son nom.

C'était un samedi soir, vers six heures, le 9 mars 1566. Les conjurés et leurs hommes d'armes, au nombre de trois cents environ, se glissèrent, à la tombée de la nuit, des ruelles borgnes de la Canongate dans les ombres du palais.

Le roi avait soupé chez lui en compagnie du comte de Morton, de Lindsey et de Ruthven. Son appartement, un rez-de-chaussée élevé de quelques marches, était situé au-dessous de l'appartement de Marie, dans la même tour. Au dessert, il envoya voir qui était avec la reine. On lui vint dire que la reine finissait de souper de son côté, dans son cabinet de repos, avec la comtesse d'Argill, sa sœur naturelle, Beatoun, le commandeur d'Holyrood, et Riccio. Leur conversation avait été enjouée et brillante. Le roi monta par un escalier dérobé, pendant que Morton, Lindsey, et une troupe de leurs vassaux les plus braves, envahissaient le grand escalier, et dispersaient sur leur passage quelques amis de la reine et de ses serviteurs.

Le roi entra dans le cabinet de Marie. Riccio, en manteau court, en veste de satin, en culotte de velours rougeâtre, était assis et couvert. Il avait sur la tête sa toque ornée d'une plume. La reine dit au roi : « Monseigneur, avez-vous déjà soupé? Je croyais que vous soupiez maintenant. » Le roi se pencha sur le dossier du fauteuil de la reine qui se retourna vers lui ; ils s'embrassèrent, et Darnley prit part à l'entretien. Sa voix était émue, son visage était pourpre, et, de temps en temps, il jetait un regard furtif vers la petite porte qu'il avait laissée entr'ouverte. Bientôt apparut, sous les franges des rideaux qui la décoraient, un homme pâle, Ruthven, qui tremblait encore de la fièvre, et qui, malgré son extrême affaiblissement, avait voulu être de l'expédition. Il était vêtu d'un pourpoint de damas, doublé de fourrure. Il avait un casque d'airain et des gantelets de fer. Il était armé comme pour un combat et accompagné de Douglas, de Ker, de Ballentyne et de d'Ormiston. Au moment où Morton et Lindsey forçaient avec fracas la chambre à coucher de Marie, et, s'y précipitant, allaient déborder dans le cabinet, Ruthven s'y rua, et son impétuosité fut telle, que le parquet en fut ébranlé. Il épouvanta les convives. Sa physionomie livide, farouche, bouleversée par la maladie et par la colère, glaçait de terreur. « Pourquoi êtes-vous ici, et qui vous a permis d'y pénétrer? » s'écria la reine. « J'ai affaire à David, à ce galant que voilà, » répondit Ruthven d'une voix sourde. Un autre conjuré s'avançant, Marie lui dit : « Si David est coupable, je suis prête à le livrer à la justice. — Voilà la justice, » répliqua le conjuré en ôtant une corde de dessous son manteau. Tout hagard de peur, Riccio recula dans un coin du cabinet. Il y fut suivi. Le pauvre Italien se rapprochant de la reine, saisit sa robe en criant : « Je suis mort! Giustizia! giustizia! Madame, sauvez-moi! sauvez-moi! » Marie s'élança entre Riccio et les assassins. Elle essaya de les arrêter. Alors chacun se pressa, se heurta dans cet étroit espace. Ce fut une mêlée, un tourbillon. Ruthven et Lindsey, brandissant leurs dirks nus, apostrophèrent rudement la reine. André Ker lui appuya même un pistolet sur le sein et la menaça de faire feu. Marie lui montrant son ventre : « Tirez, dit-elle, si vous ne respectez pas l'enfant que je porte. »

La table fut renversée dans le tumulte. La reine luttant toujours, Darnley l'entoura de ses deux bras, la ploya sur un fauteuil où il la retint, tandis que plusieurs serrant David par le cou l'arrachaient du cabinet. Douglas s'empara de la dague même de Darnley, frappa le favori, et dit, en lui laissant la dague dans le dos : « Voilà le coup du roi. » Riccio se débattait en désespéré. Il pleurait, il priait, il suppliait avec des gémissements lamentables. Il s'attacha au seuil du cabinet, puis il s'accrocha à la cheminée, puis il se cramponna au lit de la chambre de la reine. Les conjurés le menaçaient, le battaient, l'injuriaient, et lui faisaient lâcher prise en piquant ses mains de leurs armes. L'ayant enfin entraîné de la chambre à coucher dans la chambre de parade, ils le percèrent de cinquante-cinq coups de poignards.